教你正確操作小鼠免疫球蛋白A(IgA）ELISA試劑盒

　　小鼠免疫球蛋白試劑盒檢測原理:

　　小鼠免疫球蛋白試劑盒采用雙抗體步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被對稱性免疫球蛋白A(IgA)抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的對稱性免疫球蛋白A(IgA)試劑盒呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD值)，計算樣品濃度。小鼠免疫球蛋白試劑盒樣品收集、處理及保存方法:

　　1、血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

　　2、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

　　3、組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘。

　　4、取上清液保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復冷凍。

　　注：標本溶血會影響后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

　　小鼠免疫球蛋白試劑盒操作:

　　小鼠免疫球蛋白試劑盒使用，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔。

　　標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內(nèi)。加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加次。每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加次。每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結(jié)果。在450nm波長處測定各孔的OD值。局限6號標準品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標準曲線無法得到精確的結(jié)果。

　　小鼠免疫球蛋白試劑盒：

　　1、靈敏度：小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值為1.0 nmol/L。

　　2、特異性：不與其它細胞因子反應。

　　3、重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

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